Innehållsförteckning
Den prokaryota cellväggen
För att förstå hur gramfärgning fungerar och varför resultatet blir som det blir behöver man förstå hur den prokaryota cellväggen är uppbyggd. Gram själv visste inte mycket om cellväggens struktur hos de båda bakteriegrupperna och således inte heller hur hans upptäckt egentligen fungerade. Det dröjde enda till 1963 innan det stod klart hur det låg till. Då hade Hans Christian Gram varit död i 25 år. Läs också artikeln om HCJ Gram!
Nuförtiden vet vi så mycket om det här att det snabbt blir ganska komplicerat för t ex en läkarstudent med tenta i övermorgon. Men misströsta inte! På slutet finns olika varianter av sammanfattningar.
Kapsel – (hör ej till cellväggen)
Många bakterier har kapsel. Detta är som en hydrofil gel som omsluter cellen. Lagret är ofta tjockt, ibland tjockare i diameter än själva cellen. Kapseln är genomskinlig och låter sig inte enkelt färgas (men det finns särskilda kapselfärgningar). Egentligen så kallas det bara kapsel om lagret är relativt tunt. Är det tjockt kallas det istället något så roligt som slime-lager. Kapslingen består oftast av polysackarider (socker) och några få enklare polypeptider. Fördelen med kapsel, ur bakteriernas synvinkel, är att den ger visst allmänt skydd. För humanpatogena bakterier ger kapseln också ett väldigt viktigt skydd mot vårt immunsystem.
Cellväggen
Innanför kapseln, om det finns en sådan, finns cellväggen. Det finns förstås undantag: Mycoplasma och Chlamydia saknar cellvägg. Strukturen skyddar mot mekaniska skador och från osmotiska skador som beror på skillnader i vätskeinnehåll på in- och utsidan. Väggen skyddar också till viss del mot giftiga kemikalier. Balansen mellan skydd mot olika typer av skador och möjligheten att ändå få in näringsämnen respektive transportera ut skräp är viktig för att kunna växa så snabbt som bakterier ofta gör. Det som också är spännande med att cellväggen finns utanför cellmembranet är att byggstenarna måste transporteras igenom membranet för att väggen ska kunna byggas.
Det finns två principiellt skilda typer av cellvägg hos (eu)bakterier: Den grampositiva och den gramnegativa (figur 1). Färgningen är alltså så grundläggande att den definierar indelningen av bakterier pga sin uppbyggnad. Även hos bakterier som inte kan färgas med gramfärgning kan man teoretiskt räkna ut hur de borde färga in och dela in dem efter det. T ex så borde mykobakterier vara grampositiva, även om lipiderna i cellväggen gör att de inte tar upp färgen särskilt bra. Bakterien som orsakar syfilis, Treponema pallidum, borde vara gramnegativ och räknas som det, trots att den färgar in dåligt och är för tunn för att kunna ses i vanligt ljusmikroskop.
Är du biokemiskt lagd och gillar detaljer av det slaget är det här en bra sida hos NCBI. Det är ett bra ställe att börja på om du vill fördjupa dig lite mer innan det bär iväg till Pubmed 😉
Den grampositiva cellväggen
De två viktigaste komponenterna i den grampositiva cellväggen (figur 2) är peptidoglykan (även kallad mukopeptid) och teikonsyra. Den innehåller även en del kolhydrater och proteiner, vilket varierar beroende på art. Peptidoglykan finns bara hos prokaryoter och består av en glykankedja med två sorters sockermolekyler som alternerar: NAG (N-acetylglukosamin) och NAM (N-acetylmuraminsyra). Glykankedjor intill varandra sitter ihop mha korta peptider som binder varandra och hela strukturen bildar “blad”/lager.
Peptidoglykanet bildar på det här sättet en 3D-struktur som omsluter hela cellen i ett enda sammanhängande stycke, som en påse = en molekyl. Påsen är väldigt hållfast eftersom den består av en obruten struktur med kovalenta bindningar. Hos grampositiva bakterier kan väggen bestå av upp till 30 molekyler medan det hos gramnegativa oftast handlar om en till två. Det är inte många enzym i naturen som kan bryta ner peptidoglykan, men ett undantag är hydrolaset, ett lysozym, i t ex tårar. Hydrolas bryter bindningarna mellan muraminsyra och glukosamin så att peptidoglykanets NAM- och NAG-struktur går sönder. Det fungerar dock inte på gramnegativa bakterier eftersom deras yttermembran inte tillåter lysozymet att komma in till peptidoglykanet.
Häcklöpningshinder
Mitt tips är att tänka på häcklöpningshinder som när man springer och hoppar i friidrott (en mardröm om du frågar mig). NAM kan få vara det vita på själva hinderbalken och NAG det svarta (figur 3). På bilden är det mer vitt än svart men det får du bortse ifrån, det betyder ingenting i den här liknelsen. Sidopeptiderna (vertikalt) och bryggpeptiderna (längs marken) är ställningen. Din schyssta idrottslärare har staplat de här hindren vid sidan, för idag slipper du hinder – du ska bara springa, inte hoppa. När flera hinder står staplade tillsammans efter varandra kommer de att se ut som peptidoglykan, tycker jag i alla fall 😀
Teikonsyra
Den andra komponenten i den grampositiva cellväggen, teikonsyra, är en polymer av antingen glycerolfosfat eller ribitolfosfat tillsammans med olika substituenter (“utbytare”) som sockerarter, aminosyror och aminosockerarter. Teikonsyra finns bara hos grampositiva bakterier. Längden på kedjan på de här “utbytarna”/bihangen är olika beroende på art och ibland skiljer de sig åt även inom en art. Lipoteikonsyra är en typ av teikonsyra och kan vara viktig för att förankra cellväggen i cellmembranet. Teikonsyra känns igen av pattern recognition receptors (toll-liknanade receptorer) och aktiverar komplementsystemet.
Grampositiva bakterier har färre andra molekyler som utmärker dem beroende på art än vad gramnegativer har. Men de finns, t ex polysackariderna som fungerar som gruppspecifika antigen hos streptokocker.
Den gramnegativa cellväggen
Även gramnegativa bakterier har peptidoglykan, men i övrigt är de inte särskilt lika i cellväggen (figur 4). Gramnegativer har betydligt mindre mängd peptidoglykan, lagret är tunnare och består ofta av bara en eller två molekyler. Kring cellen finns ett yttermembran av fosfolipider (inte riktigt, vi kommer till det) arrangerande på det sätt som vi är vana vid när vi kallar det biologiska membran. Enda skillnaden, som faktiskt är ganska unik för gramnegativa bakterier, är att det yttre lagret i membranet istället för fosfolipider till viss del består av lipopolysackarider (LPS). LPS är oerhört giftigt för människor (och djur) och kallas även endotoxiner. Lipopolysackarider består i sin tur av lipid A, en polysackaridkärna och ett O-antigen, en sidokedja till polysackariden. O-antigenet är ett ytantigen hos gramnegativa bakterier.
Innanför yttermembranet finns det periplasmatiska rummet. Detta utrymme kan innehålla olika enzymer som kan bli ett problem vid försök att behandla cellen med antimikrobiella medel. Det finns också olika proteiner för kemotaxis och aktiv transport.
Och innanför det periplasmatiska rummet finns peptidoglykan. Som sagt, i betydligt mindre mängd än hos grampositiva bakterier.
Cellmembranet (=plasmamembranet)
Innerst har både grampositiva och -negativa bakterier ett semipermeabelt cellmembran. Det räknas inte till cellväggen, men avbildas ofta tillsammans med detta för att man ska förstå i vilken ordning strukturerna kommer. Cellmembranet består, precis som förväntat, av ett dubbelt lager med fosfolipider med de hydrofoba delarna riktade mot varandra inåt. Proteiner finns också inbyggda i cellmembranet, i större utsträckning faktiskt än hos andra organismer. Det de inte innehåller dock, som annars är vanligt, är steroler (med undantag för Mycoplasma).
Salton
Inte förrän 1963 kunde man förklara hur gramfärgning faktiskt fungerar och att skillnaden i infärgning beror på cellväggens olika uppbyggnad. Det var MJR Salton som visade att grampositiva bakterier har en genomsläpplighet i cellväggen efter att de behandlats med alkohol/aceton där peptidoglykanlagret torkas ut och små porer bildas. Kristallviolett-jodkomplexet sipprar igenom porerna och fastnar innanför. Hos gramnegativa bakterier gör alkoholen att det yttre lipidlagrets genomsläpplighet blir ännu större och färgen kan istället sippra ut igen.
Sammanfattningar
För den som har bråttom följer här två olika nivåer av sammanfattning. Den första innehåller bara det allra nödvändigaste, när det verkligen är panik. Läs under den här rubriken och titta på bilderna i resten av inlägget! Den andra sammanfattningen är en lite längre förklaring. Den kan också användas som repetition efter att du läst resten.
Är du läkarstudent rekommenderar jag även artikelserien om att välja litteratur till mikrobiologikursen (eller temat där mikrobiologin ingår).
Det allra nödvändigaste
Om en bakterie är grampositiv eller -negativ avgörs av hur cellväggen är uppbyggd. Finns det ett tjockt lager peptidoglykan kommer bakterien färga positivt och är det tunt blir den negativ.
Den lite längre förklaringen
Den grampositiva cellväggen består av peptidoglykan och teikonsyra medan den gramnegativa har ett yttermembran av fosfolipider/lipopolysackarider (LPS) och ett tunt lager peptidoglykan. Hos grampositiva bakterier gör behandling med alkohol vid gramfärgning att peptidoglykanlagret torkas ut och små porer bildas. Kristallviolett-jodkomplexet (den positiva gramfärgen) sipprar igenom porerna och fastnar innanför. Grampositiver avfärgas inte av alkohol vilket gramnegativer gör. Det yttre lipidlagret hos gramnegativa bakterier ger en ännu större genomsläpplighet vid behandling med alkohol och färgen kan istället sippra ut igen. Hos dessa har färgen alltså varit inne och vänt, men inte fastnat. De har avfärgats. Att man ändå kan se dem beror på att man motfärgar med en annan färg, safranin.
Referenser
Brauner, Arvidson, Blomberg. Medicinsk mikrobiologi och immunologi. 1:a uppl. 2015. Studentlitteratur;
Madani K. Dr. Hans Christian Jaochim Gram: inventor of the Gram stain. Primary Care Update for OB/GYNS. 01 september 2003;10(5):235–7.
Popescu A, Doyle RJ. The Gram Stain after More than a Century. Biotechnic & Histochemistry. 01 januari 1996;71(3):145–51.
Ryan, Nafees, Alspaugh. Sherris Medical Microbiology. 7:e uppl. 2018. McGraw-Hill Education;
2